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細胞色素C采用的技術(shù)指導工作分析說明

更新時間:2018-06-21      點擊次數(shù):3169
   細胞色素C是一類含有鐵啉基團的電子傳遞蛋白,只存在于需氧細胞中。細胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細胞色素C是細胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B 和細胞色素氧化酶之間,是呼吸鏈的一個重要組成部分。每分子細胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細胞色素C結(jié)晶,并已對100多種細胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行了測定。
  實驗目的:
  1、通過細胞色素C的制備,了解制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和步驟
  2、掌握制備細胞色素C的操作技術(shù)及含量的測定方法
  實驗原理:
  細胞色素是一類含有鐵啉基團的電子傳遞蛋白,只存在于需氧細胞中。細胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細胞色素C是細胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B和細胞色素氧化酶之間,是呼吸鏈的一個重要組成部分。每分子細胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細胞色素C結(jié)晶,并已對100多種細胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行了測定。
  結(jié)果表明,細胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間;不同來源細胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細胞色素C中賴氨酸含量較高,等電點為10.7,含鐵量為0.38%~0.43%,Mr為12000~13000,豬心細胞色素C分子量12200。細胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。
  細胞色素C分為氧化型和還原型兩種,氧化型水溶液呈深紅色,還原型水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱比較穩(wěn)定,不易變性。pH 7.2~10.2,100℃加熱3分鐘,細胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,若增加加熱時間,氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定,可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細胞色素C制成還原型的,因為比較穩(wěn)定并易于保存。
  細胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶,廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運動的肌肉中含量zui為豐富。細胞色素C 位于線粒體的蛋白質(zhì)—脂質(zhì)絡(luò)合物中,分子量約為13000,肽鏈中含有19個賴氨酸殘基,為一堿性蛋白, 等電點(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉,它是一種陽離子交換劑,細胞色素C 分子剛好進入它的表面空隙。在pH7.5時細胞色素C 呈正電荷,它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換,從而被沸石吸附。裝入層析柱后,用25%硫酸銨洗脫,又可將細胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細胞色素C 純度,主要為去除雜蛋白。另外乙酸可引起細胞色素C 變性和聚合,必須嚴格控制酸用量。
  細胞色素C與材料試劑
  1、 設(shè)備:組織搗碎機、酸度計、離心機、分光光度計、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。
  2、 儀器:剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。
  3、 試劑:聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、、人造沸石、氫氧化銨。
  4、 材料:新鮮豬心(2個)。
  結(jié)果表明,細胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間;不同來源細胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細胞色素C中賴氨酸含量較高,等電點為10.7,含鐵量為0.38%~0.43%,Mr為12000~13000,豬心細胞色素C分子量12200。細胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。細胞色素C分為氧化型和還原型兩種,氧化型水溶液呈深紅色,還原型水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱比較穩(wěn)定,不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘,細胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,若增加加熱時間,氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定,可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細胞色素C制成還原型的,因為比較穩(wěn)定并易于保存。
  細胞色素C不是根據(jù)輔基來命名;與其他三類細胞色素非共價結(jié)合血紅素不同的是,細胞色素c通過分子中的半胱氨酸巰基與血紅素共價結(jié)合。細胞色素e尚無,但有細胞色素f(細胞色素c中的一種)。[3]此外,細胞色素d僅存在于細菌中。
  在線粒體和葉綠體中,細胞色素常常結(jié)合在電子傳遞和相關(guān)代謝途徑的復合物酶中。
  細胞色素C過敏試驗
  細胞色素C是一種輔酶,在生物氧化過程中起著傳遞電子的作用,改善缺氧時的細胞呼吸,促進物質(zhì)代謝,臨床多用做能量合劑的配方。應用時要警惕過敏反應。為防止過敏反應,在用藥前應先作過敏試驗。
  一、皮試液的配制
  取細胞色素C(每支2ml含15mg)0.1ml加等滲鹽水至1ml,每ml含 0.75mg 。
  二、試驗方法
  (一) 皮內(nèi)試驗 取細胞色素C試驗液 0.1ml(含0.075mg),作皮內(nèi)注射,觀察20分鐘后,判斷試驗結(jié)果。
  (二)劃痕試驗 取細胞色素C原液(每ml含2.5mg)1滴,滴于前臂內(nèi)側(cè)皮膚上作劃痕法(以無菌針頭透過藥液,劃刺皮膚兩道,長約5mm,其深度以不出血為宜。即劃破皮不出血。)觀察20分鐘后判斷試驗結(jié)果。
  三、試驗結(jié)果判斷
  局部發(fā)紅,直徑大于1cm,有丘疹者陽性。
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